BANCADA: URÉIA CE (Labtest, 2008).

A Uréia CE é um sistema enzimático-colorimétrico para a determinação da uréia em amostras de sangue e urina, por reação de ponto final (fig. 1 e 2).

Fig. 1. Kit Uréia CE Labtest. 
A uréia é hidrolisada pela urease a íons amônio e CO2. Os íons amônio reagem em pH alcalino com salicilado e hipoclorito de sódio, sob a ação catalisadora do nitroprussiato de sódio para formar azul de indofenol.

Fig. 2. Kit aberto de Uréia CE da Labtest.

A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de uréia na amostra.

Espectrofotômetro com leitura em absorbância entre 580 a 620 nm.

Reagentes
1. Urease - Armazenar entre 2 - 8 °C. (fig. 3).
2. Tampão - Estoque - Armazenar entre 2 - 8 °C. (fig. 4).
3. Oxidante - Estoque - Armazenar entre 2 - 8 °C. (fig. 5).
4. Padrão 70 mg/dL - Armazenar entre 2 - 8 °C. Contém azida sódica. (fig. 6)

Fig. 3. Frasco n. 1 – Urease

Fig. 4. Frasco n. 2 – Tampão

Fig. 5. Frasco n. 3 – Oxidante

Fig. 6. Frasco n. 4 – Padrão

Amostra:

Usar soro ou plasma (fluoreto, oxalato, heparina, EDTA) e urina. Não usar anticoagulantes contendo amônia. A concentração de fluoreto na amostra não deve ser maior que 3 mg/mL pois o fluoreto em altas concentrações é inibidor da urease.
A uréia é estável no soro ou plasma por 12 horas entre 15 - 25 °C e vários dias entre 2 - 8 °C.
A urina de 24 horas deve ser colhida em frasco contendo 2,0 mL de HCl 50% e centrifugada antes de usar. Não utilizar formol como preservativo para a urina.

Preparo de Reagentes
Tampão de Uso (Frasco n. 2)
Adicionar o conteúdo do frasco nº 2 (100 mL) a 400 mL de água destilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses em frasco âmbar entre 2 - 8 °C.

Oxidante de Uso:
Adicionar o conteúdo do frasco nº 3 (25 mL) a 475 mL de água destilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses em frasco plástica entre 2 - 8 °C.

Urease Tamponada:
Adicionar 1,0 mL de Urease (nº 1) a 20 mL do Tampão de Uso. Estável 21 dias em frasco de vidro âmbar entre 2 - 8 °C.

Procedimento para urina
Para a dosagem de uréia na urina, diluir a amostra 1:50 (0,1 mL de urina + 4,9 mL de água
destilada ou deionizada). Multiplicar o resultado obtido por 50.

Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

	BRANCO	TESTE	PADRÃO
AMOSTRA	----	0,01 mL	----
PADRÃO (n. 4)	----	----	0,01 mL
Urease Tamponada	1,0 mL	1,0 mL	1,0 mL

Misturar e incubar a 37 °C durante 5 minutos.

	BRANCO	TESTE	PADRÃO
Oxidante de uso	1,0 mL	1,0 mL	1,0 mL

Cálculos

Uréia (mg/dL) = (Abs. do teste / Abs. do padrão) x 70

Ex:

Abs. do teste = 0,269

Abs. do padrão = 0,610

Uréia (mg/dL) = (0,269 / 0,610) X 70 = 31 mg/dL

Ou pode-se obter pelo fator de calibração:

Fator de calibração = 70 / Abs. do padrão

mg/dL = Abs. do teste X Fator de calibração

Ex:

Fator = 70 / 0,610 = 114,8

Uréia (mg/dL) = 0,269 X 114,8 = 31 mg/dL

“ É IMPORTANTE RESSALTAR QUE NA HORA DA PROVA VOCÊ DEVERÁ FAZER A DILUIÇÃO ESPECÍFICA, OU SEJA SOMENTE A QUANTIDADE DE UREASE E TAMPÃO DE USO QUE VOCÊ IRÁ UTILIZAR, ISSO É FEITO DE FORMA SIMPLES, ATRAVÉS DE REGRA DE TRÊS.”

Lembre-se: Como o volume da amostra é pequeno, deve-se pipetar diretamente no fundo do tubo de ensaio realizando uma medição cuidadosa para minimizar problemas de imprecisão.

Precauções, cuidados especiais e interferências e mais detalhes no site da Labstest – http://www.labtest.com.br.

 

BANCADA: PT Hemostasis: Tempo de protrombina (Labtest, 2005).

A finalidade deste exame é a determinação do tempo de protrombina (TP) (fig. 1) e medição dos fatores do complexo protrombínico (fatores II, V, VII e X).

Fig. 1. Kit coagulométrico Labtest para TP.

A tromboplastina (fator tissular, fator III) desencadeia o mecanismo de coagulação da via extrínseca formando, com o fator VII, um complexo estequiometricamente (da termodinâmica: mistura perfeita) dependente do cálcio. O fator VII é transformado em uma enzima ativa (fator VIIa), que atua sobre o fator X gerando o fator Xa e este juntamente com fosfolípides do fator tissular, fator Va e cálcio formam o Complexo Ativador da Protrombina, que transforma a protrombina em trombina. Essa, por sua vez, atua sobre o fibrinogênio gerando fibrina. A formação da fibrina é macroscopicamente demonstrada pelo aparecimento de um coágulo. O TP é o tempo necessário para a formação de fibrina a mistura de tromboplastina, plasma e cálcio. Os resultados são obtidos através da comparação entre os tempos de coagulação do plasma de pacientes e do plays de referência, representando a medida da atividade dos fatores do complexo protrombínico (fatores II, V, VII, X).

O reagente PT Hemostasis (fig. 2) contém tromboplastina extraída do cérebro de coelho que tem grande sensibilidade às deficiências isoladas ou combinadas dos fatores II, fator V, fator VII e fator X, quando comparada com outras tromboplastina de cérebro de coelho.

Fig. 2. Frascos de reagente n. 1. pertencentes ao kit PT Hemostasis da Labtest.

Metodologia deste exame é coagulométrica – QUICK.

O componente do kit é o reagente 1 que contém material liofilizado contendo extraído de cérebro de coelho >2% em tampão tricina (tipo de aminoácido derivado da glicina, utilizado como tampão quando não é possível utilizar tampão fosfato), azida sódica e demais estabilizadores (fig. 3).

Preparo do reagente: Adicionar ao frasco do reagente n.1 o volume exta de água tipo II indicado no rótulo (fig. 3). Recolocar a tampa e homogeneizar suavemente e deixar em repouso a temperatura ambiente (entre 15 a 25°C) durante 15 minutos. Antes de utilizar, homogeneizar suavemente, não agitando por inversão ou vigorosamente.

Fig. 3. Frascos dos reagentes do kit PT HEMOSTASIS, no frasco da esquerda o extrato liofilizado, e o frasco da direita o reagente já pronto para uso em sua forma líquida quando é adicionada a água tipo II.

Precauções e cuidados especiais: Utilizar EPI´s devido a natureza tóxica da azida sódica e cuidados habituais em relação ao risco biológico da amostra.

Material necessário para realização do exame: Banho-maria, Pipetas e cronômetro.

Na prova de TP o cronômetro é o principal instrumento pois através dele que iremos mensurar o tempo da coagulação do plasma citratado.

Amostra: Plasma colhido em citrato trissódico anidro.

Interferências analíticas: Amostra ictéricas, lipêmicas e hemolisadas podem modificar os resultados de modo imprevisível.

PROCEDIMENTO

1. ter um pool de plasma citratados obtidos de, no mínimo, 3 indivíduos sadios (não será necessário na hora da prática no H119 e na prova).

2. Realizar o teste em tubos de vidro rigorosamente limpos.

3. A temperatura do banho-maria deve estar entre 36-38°C (fig. abaixo).

4. Incubar 0,1 mL do plasma a ser medido (referência, controle ou paciente) por no mínimo um minuto e no máximo 10 minutos.

5. Adicionar 0,2 mL do Reagente 1 (previamente aquecido a 37 °C) e disparar simultaneamente cronômetro. Misturar suavemente e manter no banho-maria por 9 segundos.

6. Remover o tubo, incliná-lo sucessivamente em intervalos menores que 1 segundo e observar a formação de um coágulo que interrompe a movimentação do líquido. Parar imediatamente o cronômetro e registrar o tempo.

Alça de Drygalsk ou também alça de platina é necessária para confirmar e segurar o coágulo presente no tubo.

Mais detalhes sobre colheita e preparo da amostra, interferências analíticas e outros informações, procure no site da LABTEST – http://www.labtest.com.br

BANCADA: Albumina (Labtest, 2005).

A albumina é uma proteína de alto valor biológico presente principalmente na clara do ovo, no leite e no sangue, sendo a principal proteína do plasma sanguíneo, sendo sintetizada no fígado pelos hepatócitos.

Fig. 1 Estrutura tridimensional da Albumina.

No kit ALBUMINA Cat. 19, a determinação deste componente sérico é por reação de ponto final. Por albumina ter propriedades de se ligar à uma grande gama de ânions orgânicos e moléculas complexas de corante, o sistema de medição baseia-se no desvio do pico de absortividade máxima de um corante complexo – o Verde de Bromocresol (VBC) – quando se liga à albumina. A cor formada é medida colorimetricamente entre 620 a 640 nm, sendo proporcional à quantidade de albumina na amostra até a concentração de 6,0 g/dL.

O VBC também chamado de Tetrabromometacresolsulfonoftaleína (fig. 2) é um composto químico utilizado principalmente como corante indicador, de aparência sólida, em forma de cristais, de cor amarelo claro e inodoro. É um composto tóxico e deve-se evitar a sua inalação, como o contato com a pele e olhos.

Fig. 2. Estrutura molecular do Tetrabromometacresolsulfonoftaleína, ou simplesmente verde de bromocresol.

Ele possui especificidade para a albumina, tendo uma excelente correlação com o fracionamento eletroforético em acetato de celulose e é facilmente aplicável à maioria dos analisadores semi-automáticos e automáticos capazes de medir uma reação de ponto final entre 625 e 640 nm.

A metodologia utilizada por este kit (fig. 3) é o Verde de Bromocresol, tendo no kit um frasco de reagente de cor que contém o tampão misturado com o verde de bromocresol, identificado pelo frasco n. 1. No frasco n. 2 há o padrão 3,8 g/dL, que é albumina bovina e azida sódica (fig. 4).

  Fig. 3. Caixa do Kit ALBUMINA do fabricante LABTEST.

Precauções recomendadas: Evitar a contaminação dos reagente por natureza química ou microbiológica que reduzem a estabilidade dos mesmo. E para o técnico a preocupação com a BIOSSEGURANÇA, então utilize EPI´s.

Fig. 4. Componentes do kit de ALBUMINA da Labstest, à esquerda o reagente de cor identificado como frasco n. 1. De tampa verde, identificado com a numeração 2, o padrão do kit.

AMOSTRA: Não usar plasma e sim soro sanguíneo.

POSSÍVEIS INTERFERÊNCIAS: Bilirrubinas acima de 38 mg/dL, hemoglobina acima de 180 mg/dL e triglicérides acima de 250 mg/dL que produzem diferenças significativas positivas.

INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS: Relatado em pacientes que possuam obesidade, o valor de albumina tender a ser mais baixo. Torniquetes por mais de 3 minutos provocam o aumento do valor da albumina. Amostras obtidas com heparina de lítio e oxalato de potássio combinado  com fluoreto de sódio fornecem resultados falsamente diminuídos.

PROCEDIMENTOS: Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

	BRANCO	TESTE	AMOSTRA
Reagente de cor (n. 1)	1,0 mL	1,0 mL	1,0 mL
Amostra	----	0,01 mL	----
Padrão	----	----	0,01 mL

Misturar e após 2 minutos, no máximo 10 minutos, determinar as absorbâncias do teste e padrão em 630 nm (no espectrofotômetro – fig. 5) ou filtro vermelho (600 a 640) acertando o zero com o branco.

Fig. 5. Espectrofotômetro presento na sala H119, da Universidade de Uberaba – UNIUBE.

O volume mínimo para leitura fotométrica é de 1,0 mL, em casos de redução dos volumes é fundamental a atenção porque pode haver um aumento da imprecisão da medição.

CÁLCULOS:

ALBUMINA (g/dL) = (Abs. do teste / Abs. do padrão) X 3,8

Exemplo: Abs. do teste = 0,242 e Abs. do padrão = 0,302

ALBUMINA (g/dL) = (0,242 / 0,302) X 3,8 = 3,0 g/dL

A reprodutibilidade pode ser obtida pela seguinte conta, conforme recomendada pelo fabricante:

Fator de Calibração = 3,8 / Abs. do padrão

ALB (g/dL) = Absorbância do teste X fator de calibração

Exemplo:

FATOR: 3,8 / 0,302 = 12,6 g/dL

ALB (g/dL) = 0,242 X 12,6 = 3,0 g/dL.

OS DETALHES SOBRE O KIT ALBUMINA cat. 19 PODEM SER OBTIDOS NO SITE DA LABTEST: http://www.labtest.com.br.

REFERÊNCIA: ALBUMINA. Responsável técnico LABTEST DIAGNÓSTICA S.A. Lagoa Santa: LABTEST, 2005. Bula do kit colorimétrico.

BANCADA: Proteínas Totais (Labtest, 2005).

Em seu catálogo de testes, o Labtest oferece a determinação colorimétrica das Proteínas Totais em amostras de soro sanguíneo, líquidos pleurais, sinoviais e ascítico por reação de ponto final.

O exame funciona da seguinte forma, o reagente presente no kit (o Biureto), que possui íons cobre (Cu⁺²) que está em meio alcalino, quanto misturado a amostra liga-se as ligações peptídicas das proteínas séricas formando um alteração de cor (púrpura), que tem absorbância máxima em 545 nm.

O Reagente de biureto (RB) é um reagente analítico feito de hidróxido de potássio (KOH) e sulfato de cobre (II) (CuSO₄), junto com tartarato de sódio e potássio (KNaC₄H₄O₆·4H₂O). Este reagente de coloração azul torna-se violeta na presença de proteínas, e muda para rosa quando combinado com polipeptídeos de cadeia curta. O hidróxido de potássio não participa na reação, mas meramente provê um meio alcalino no qual a reação ocorre.

                          

ESQ.: Esquematização molecular do reagente de biureto e DIR: foto do reagente de biureto (fonte: Internet).

O RB é estável, tem elevada sensibilidade tendo resposta positiva à todas as proteínas do soro, principalmente quanto o soro tem concentrações moderadas de bilirrubina e hemoglobina. No entanto, concentrações séricas de triglicérides maiores  que 500 mg/dL podem produzir interferências positivas que podem ser minimizadas utilizando como branco a amostra.

No kit LABTEST (fig. 1) estão presente o reagente de biureto (nº 1 – fig. 2) pronto para uso, padrão (nº 2 – fig. 3) composto por albumina bovina e azida sódica (sal incolor comum em sínteses orgânicas).

    Fig. 1: Kit LABTEST de Proteínas Totais.

CUIDADOS: Não pipetar os reagente coma boca, pois serem corrosivos podem causar queimaduras, e sempre utilizar luvas para realizar os procedimentos. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que as amostras não são infectantes, é obrigatório o uso de EPI´s.

Fig. 2: Reagente de Biureto do kit, frasco n. 1.

A amostra deve ser de soro e líquidos (pleural, sinovial ou ascítico), sendo esta metodologia não adequada para dosagem das proteínas na urina e no líquor.

Fig. 3: Frasco n. 2 - Padrão

PROCEDIMENTOS: Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

	BRANCO	TESTE	PADRÃO
Amostra	----	0,02 mL	----
Padrão (n. 2)	----	----	0,02 mL
Água Destilada ou deionizada	0,02 mL	----	----
Reagente de Biureto	1,0 mL	1,0 mL	1,0 mL

Misturar e incubar a 37º C durante 10 minutos (banho-maria – fig. 4). Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 545 nm (530 a 550), acertando o zero com o branco. A cor é estável durante 1 hora, ou seja, depois que preparação dos tubos podemos ler no espectrofotômetro até uma hora depois da incubação. Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados proporcionalmente sem o prejuízo do teste.

Fig. 4: Aparelho de incubação (banho-maria).

Após o procedimento realiza-se o cálculo caso o espectrofotômetro não seja semi-automático, pela seguinte conta:

Proteínas Totais = (Abs. do teste / Abs. do padrão) X (4 g/dL).

Sendo que 4 g/dL é a concentração de PTotais do padrão.

Então:

Abs. do teste = 0,405

Abs. do padrão = 0,238

Proteínas totais = (0,405 / 0,238) X 4 g/dL = 6,80 g/dL

Outra conta que pode-se ser utilizada é baseado no intervalo de linearidade, ou seja:

Fator de calibração = 4 g/dL / Abs. do padrão

Utilizando o exemplo anterior:

Fator de calibração = 4 g/dL / 0,238 = 16,80 g/dL

Se a fórmula para Proteínas Totais é:

Proteínas Totais = Absorbância do teste X Fator de calibração (g/dL)

Logo,

Proteínas Totais = 0,405 X 16,80 g/dL = 6,80 g/dL

É aceitável um desvio de ± 10%.

PARA SABER MAIS DETALHES SOBRE AS INSTRUÇÕES DE USO DO KIT PROTEÍNAS TOTAIS, ACESSE: http://www.labtest.com.br

REFERÊNCIA: PROTEÍNAS TOTAIS. Responsável técnico Labtest Diagnóstica S.A. LAGOA SANTA: Labtest, 2005. Bula de Kit.